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谈中药饮片鹿血晶PCR检测方法的建立

作者:2017-01-04 15:17阅读:文章来源:未知
  目前市场上含有鹿血的保健品有十几个品种,但是由于鹿血来源稀少及其珍贵的药用价值,所以市场上鹿血成分鱼目混珠,常用比较廉价的猪血、羊血、牛血等动物血以假乱真。传统的方法无法区分动物血的来源。DNA 核酸序列和特异引物PCR 扩增在动物药材鹿茸、鹿鞭、乌梢蛇、龟板、土鳖虫、蜈蚣等鉴定方面都取得了良好效果,但其在鹿血来源的应用还无相关报道。因此本研究为了鉴别中药饮片鹿血晶的真伪,建立PCR 检测方法。
  1 材料和方法
  1. 1 试剂DNA 提取试剂盒( 天根: TIANamp GenomicDNA Kit,吸附柱批号: M1104) ; DREAM TaqGreen Pcr Master Mix( 2 × ) 12. 5μL( Thermo Scientific,批号: 00108596) ; 引物序列见表1,由上海生工合成。
  1. 2 药材梅花鹿血、牛血、猪血( 由苏州市红冠庄国药饮片有限公司提供) ; 鹿血晶1购于苏州市红冠庄国药饮片有限公司( 批号: 1211022) ; 鹿血晶2 购于合肥乐家老铺中药饮片有限公司( 批号:12040102) 。
  1. 3 实验仪器高速低温离心机: Thermo scientificBiofuge primo R; 凝胶成像系统: GEL DocTM XR +Bio RAD; 电泳仪: Bio - RAD Power Pac TM Basic;PCR 仪: AB AppLied Biosystems。
  1. 4 方法
  1. 4. 1 模板DNA 提取按试剂盒使用说明提取鹿血( 鹿全血约50μL) 、牛血( 牛全血约50μL) 、猪血( 猪全血约50μL) 和鹿血晶( 约15mg) 的基因组DNA。
  1. 4. 2 PCR 反应体系在200 μL 离心管中进行,反应总体积为25 μL,DREAM Taq Green Pcr MasterMix ( 2 × ) 12. 5 μL ( Thermo Scientific,批号:00108596) ,20μM 的引物各0. 75 μL,DNA 模板1. 25 μL,去离子水9. 75 μL。阴性对照为灭菌去离子水。阴性对照试验除反应中不加模板DNA 外,均按上述测定条件和步骤进行。
  1. 4. 3 PCR 反应循环参数。
  1. 4. 4 电泳检测称取适量的琼脂糖加入1 × TAE缓冲液中,配置成质量浓度为1. 5% 的溶液,加热溶解,稍加冷却后,加入GeLRed 溶液至终浓度为0. 1μg /mL。制胶时将凝胶倒入盛有1 × TAE 缓冲液的电泳槽中,垂直向上拔去梳版。吸取5 ~8μLPCR 扩增产物点样。其中一个泳道中加入DNA分子量标准品3 ~ 6μL 作用( 按试剂说明确定加样量) ,接通电源电泳,按5V/cm 的电压电泳30 ~60min。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。
  1. 4. 5 结果判断凝胶电泳图谱中,待测鹿血晶在与梅花鹿血液对照品凝胶电泳图谱相应的位置上( 408bp) ,有单一DNA 条带为正品。
  2 结果
  2. 1 采用文献报道的鹿、牛和猪特异性基因片段引物,用鹿、牛和猪的全血提取基因组后进行PCR 扩增,扩增后电泳结果。它们各自PCR 产物的大小分别为鹿408bp,牛271bp 和猪149bp。
  2. 2 用鹿特异性引物,扩增不同动物血液来源基因组结果见图2。可见该引物对鹿血具有特异性。其不能扩增出牛和猪血的特异性条带,而对鹿血和鹿血与其它动物血的混合物( 两者1∶ 1混合) ,能扩增出特异性条带。
  2. 3 不同来源鹿血晶PCR 扩增结果见图3。选取市场上两个生产厂家的鹿血晶,经PCR 检测,均检出鹿特异性目的条带。
  2. 4 不同含量鹿血晶PCR 扩增结果。称取不同量的鹿血晶,进行基因组DNA 提取,提取后进行PCR 扩增,发现当鹿血晶的含量为1. 51mg 时( 为常规用量十分之一左右) 仍能扩增出目的条带。
  3 讨论
  中药饮片鹿血晶为纯梅花鹿或马鹿血制成,其性热、味甘咸,具有养血益精,行血祛瘀、消肿疗伤等作用。现代研究表明,鹿血制品含有丰富的造血干细胞和多种造血因子,包括G - CSF、GM - CSR、M - CSF 等。目前市场上鹿血成分鱼目混珠。有关鹿血的鉴别,虽然有免疫学抗原抗体沉淀法、聚丙酰胺凝胶电泳等方法报道,但由于方法繁琐等原因,这些方法未能得到广泛应用。本研究选用的引物,针对《中华人民共和国药典》规定其正品为鹿科动物梅花鹿或马鹿的线粒体基因设计,对鹿血基因组DNA 进行PCR 扩增,可以得到预期大小的目的片段; 两批市售鹿血晶饮片检出和鹿血大小一致的目的片段; 对牛血、猪血基因组DNA 进行PCR 扩增,未得到预期大小的目的片段;对不同含量鹿血晶PCR 扩增结果发现当鹿血晶的含量为1. 51mg 时( 约为常规用量15mg 左右的十分之一) 仍能扩增出目的条带。故对样品DNA 提取液进行鹿内源基因的PCR 扩增,以鹿基因组DNA作为阳性对照,如阴性对照未出现扩增条带,阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带,则可初步判断待测样品含有鹿源性成分。如待测样品未出现PCR 扩增产物,则可判断待测样品不含鹿源性成分( 或极其微量) 。本方法的局限性: 1) 只能检测出是否含有鹿血成分,无法对其含量进行测定。
  2) 根据文献报道,本研究选用的鹿引物是针对梅花鹿和马鹿,而对其他品系鹿血的样品是否可以分辨,由于取材困难,本文未做相应的探讨。
  3) 本研究只探讨了鹿血晶常见伪品血来源猪血和牛血对该方法检测不具有干扰,而该方法对其他鹿血晶伪品血是否能有效检出,有待于进一步研究。
 

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