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马钱子散中马钱子总生物碱的含量测定方法讨论

作者:2016-12-29 16:01阅读:文章来源:未知
  马钱子又名番木鳖,是马钱科植物马钱Strychnos nuxvomicaL. 的干燥成熟种子,始载于《本草纲目·卷十八》,性味苦温,有大毒,归肝、脾经,具有通络止痛、散结消肿之功效,用于跌打损伤、风湿顽痹,麻木瘫痪,咽喉肿痛等。现代研究表明马钱子中含有生物碱类、苷类、有机酸类等成分,其中以生物碱为主要有效成分和有毒成分,含量约1. 5% ~ 5%,至少含16 种生物碱成分,其中士的宁、马钱子碱为主。马钱子有大毒,临床使用剂量较小,因此需要建立合适的方法进行质量控制,以保证临床应用的安全与有效。马钱子散为我单位院内制剂,临床治疗中风瘫痪等疾病疗效确切,本文以溴百里香酚蓝为酸性染料,马钱子碱和士的宁为对照品,采用酸性染料比色法测定其总生物碱含量,为其质量控制提供依据。
  1 仪器与试药
  1. 1 仪器设备
  UV - Vis2450 型紫外- 可见分光光度仪( 日本岛津) ;JA2003N 电子天平( 上海精密科学仪器有限公司) ; XS105 分析天平( 梅特勒- 托利多仪器上海有限公司) ; DGG - 9053A型电热恒温鼓风干燥箱( 上海森信实验仪器有限公司) ; DZF- 6050 型真空干燥箱( 上海顿克仪器科技有限公司) ; DKS- 24 型电热恒温水浴锅( 上海经济区沈荡中新电器厂) 。
  1. 2 试药
  马钱子散( 自制) ; 马钱子碱对照品( 批号110706 -200505,含量测定用,中国药品生物制品检定所) ; 士的宁对照品( 批号110705 - 200306,含量测定用,中国药品生物制品检定所) ; 溴百里香酚蓝为分析纯( 上海三爱恩试剂有限公司) ; 磷酸二氢钾为分析纯( 天津市永大化学试剂有限公司) ; 氢氧化钠为分析纯( 天津市永大化学试剂有限公司) ;氯仿为分析纯( 衢州巨化试剂有限公司) 。
  2 方法与结果
  2. 1 显色剂的配制
  ( 1) pH7. 2 磷酸缓冲溶液配制: 取0. 2 mol /L 磷酸二氢钾50 mL 与0. 2 mol /L 氢氧化钠溶液35 mL,加新沸过的冷水稀释至200 mL,摇匀,即得。
  ( 2) 显色液配制: 精密称取0. 01 g 溴百里香酚蓝,用磷酸缓冲溶液溶解并定容至40 mL,摇匀,即得。
  2. 2 供试品溶液的制备
  精密称取马钱子散( 过200 目筛) 约0. 35 g,置具塞锥形瓶中,加氢氧化钠试液3 mL,混匀,放置30 分钟,精密加入三氯甲烷20 mL,密塞,称定重量,置水浴中回流提取2h,放冷,再称定重量,用三氯甲烷补足失重,摇匀,分取三氯甲烷提取液,用铺有少量无水硫酸钠的滤纸滤过,弃去初滤液,精密移取续滤液4. 5 mL,置50 mL 容量瓶中,用氯仿稀释至刻度,摇匀,既得。
  2. 3 对照品溶液的配制
  取士的宁对照品约5 mg,马钱子碱对照品约5 mg,精密称定,分别置10 mL 容量瓶中,分别用氯仿溶解并定容至刻度,即得马钱子碱对照品溶液和士的宁对照品溶液( 每1mL 中含士的宁0. 1002 mg,马钱子碱0. 1002 mg) 。
  2. 4 显色方法
  精密吸取对照品或样品溶液,真空干燥去溶剂,分别加入4 mL 显色剂和6 mL 氯仿,密塞,剧烈振摇2 min,室温静置12 h,分取氯仿层。
  2. 5 检测波长的选择
  取对照品和供试品溶液各0. 5 mL,并按照“2. 4”项下方法显色,在300 ~ 500 nm 波长范围内扫描,比较供试品溶液与对照品溶液吸收光谱,如图1 所示,可见三者的最大吸收波长基本相同,因此确定416 nm 为检测波长。2. 6 样品测定方法精密吸取对照品或样品溶液,挥去溶剂,分别加入4mL 显色剂和6 mL 氯仿,密塞,剧烈振摇2 min,室温静置12 h,分取氯仿层,于416 nm 处测定吸光度。另取等量氯仿,同法操作,作为试剂空白。
  2. 7 方法学考察
  2. 7. 1 线性关系考察精密吸取“2. 3”项下的士的宁、马钱子碱对照品溶液各0. 2、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8 mL,挥去溶剂,分别加入pH7. 2 的溴百里香酚蓝4 mL,再加6 mL 氯仿,密塞,剧烈振摇2 min,转移到分液漏斗中,静置12 h,分取氯仿层,于416 nm 处测定吸光度。以士的宁、马钱子碱浓度对吸光度分别进行线性回归,得到士的宁回归方程Y= 8. 398 4X + 0. 019 1( R2 = 0. 999 1) ,说明士的宁在0. 0200 ~ 0. 080 2 mg /mL 范围内呈良好的线性关系,得马钱子碱回归方程Y = 6. 959 4X + 0. 006 7( R2 = 0. 999 3) ,说明马钱子碱在0. 020 0 ~ 0. 080 2 mg /mL 范围内呈良好的线性关系。
  2. 7. 2 精密度试验取“2. 3”项下的士的宁对照品溶液和马钱子碱对照品溶液各1 份,按照“2. 6”项下的方法测定吸光度,连续测定6 次,结果士的宁、马钱子碱对照品溶液吸光度的RSD 分别为0. 08%、0. 11%,表明仪器精密度较好。
  2. 7. 3 稳定性试验取“2. 2”项下的马钱子供试品溶液,根据按照“2. 6”项下的方法显色后,分取氯仿层,分别在0、2、4、6、8、10、12 h 时取样在416 nm 处测定吸光度,结果其RSD 为2. 24%,表明供试品溶液显色后在12 h 内稳定性较好。
  2. 7. 4 重复性试验取同一批马钱子散( 过200 目筛) 6份,每份约0. 35 g,精密称定,按照“2. 2”项制备马钱子供试品溶液,按照“2. 6”项下的方法测定吸光度; 另取士的宁、马钱子碱对照品液适量,随行标准曲线。结果,以士的宁计马钱子总生物碱含量为2. 50%,RSD 为1. 50%,以马钱子碱计马钱子总生物碱为3. 13%,RSD 为1. 45%,表明该方法重复性好。
  2. 7. 5 加样回收试验取已知含量的马钱子散( 过200 目筛) 6 份,约0. 2 g,精密称定,各加入士的宁对照品约5 mg( 精密称定) ,置具塞锥形瓶中,按照“2. 2”项下方法制备供试品溶液,按照“2. 6”项下的方法测定吸光度,随行士的宁标准曲线,计算总生物碱含量与回收率。
  取已知含量的马钱子散( 过200 目筛) 6 份,约0. 2 g,精密称定,加入马钱子碱对照品约6mg( 精密称定) ,置具塞锥形瓶中,按“2. 2”项下方法制备供试品溶液,按照“2. 6”项下的方法测定吸光度,随行马钱子碱标准曲线,计算总生物碱含量与回收率。
  3 分析与讨论
  生物碱是存在于生物体内的含氮有机化合物,具有很强的生理活性,广泛应用于临床。高效液相色谱法、气相色谱法等方法具有专属性好,灵敏度高、准确好等优点,但主要用于测定一种或少数几种单体生物碱含量,而不适用于一些生物碱成分众多的中药材或其提取物。酸性染料比色法是目前测定总生物碱的常用方法。
  目前,马钱子中生物碱类成分的质量控制通常采用HPLC 等方法测定马钱子碱和士的宁的含量,但马钱子中其他生物碱成分也具有很强的药理活性,如马钱子碱氮氧化物具有类似于阿司匹林样抑制血小板聚集和抗血栓形成的作用,而毒性只有马钱子碱的1 /15,异士的宁的抗肿瘤效果强于士的宁。因此,本文以溴百里香酚蓝为酸性染料,采用酸性染料比色法测定其总生物碱含量。
  酸性染料比色法测定总生物碱含量,需充分考虑显色液pH 值、显色时间及温度、酸性染料及其浓度、水分的影响和有机溶剂的选择等影响因素。其中,显色液pH 值对测定结果影响很大,本文通过预试验确定显色液pH7. 2,静置时间为12 h。本文建立采用酸性染料比色法测定总生物碱含量的方法,准确,稳定,重复性好,与文献报道一致,可以用于马钱子散中马钱子总生物碱的含量测定,以控制其质量。
  本文实验结果表明,马钱子散中马钱子总生物碱含量,以士的宁、马钱子碱计,分别为2. 54%与3. 16%,有一定差异,说明对于总生物碱等中药有效部位的含量测定,对照品的选择很重要。三个批次的马钱子散中马钱子总生物碱含量也有一定差异,这可能主要与原药材及炮制工艺有关,提示中药制剂的质量控制须注意各个环节。
 

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