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姜黄素对结肠癌细胞株NKD2 及CXCR4基因表达影响的讨论

作者:2016-12-08 15:25阅读:文章来源:未知
  随着人们生活方式和饮食结构及习惯的改变, 结肠癌的发生率不断升高。结肠癌作为消化道常见的恶性肿瘤,严重危害着人们的健康。肿瘤转移作为结肠癌恶化的特征之一, 也是结肠癌患者死亡的主要原因。因此,如何有效地抑制结肠癌的转移是临床面临的主要难题。同时,研究发现肿瘤的侵袭转移与趋化因子密切相关。CXCR4 作为趋化因子CXCL12的惟一受体,参与多种病理和生理的过程。目前研究表明,CXCL12/CXCR4 构成的生物轴介导恶性肿瘤浸润转移中起着非常重要的作用。CXCR4作为肿瘤细胞中最常见的趋化因子受体,在胃癌、结肠癌、软组织肉瘤等多种肿瘤细胞中表达均明显增加。
  姜黄素(Curcumin,Cur) 是从姜科植物CurcumaLonga 的根茎姜黄中提取的一种植物多酚类物质,具有抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗衰老、消除自由基等作用。近年来,国内外对于姜黄素的抗肿瘤作用及其机制做了大量的研究, 发现姜黄素对多种肿瘤的侵袭转移具有明显的抑制效果。有研究报道姜黄素能显著性降低β-catenin 基因表达水平,从而抑制Wnt 信号通路,起到抗肿瘤的作用。目前有研究发现NKD2 作为Wnt 通路的抑制因子,具有调控Wnt 信号通路的作用。因此,本实验以姜黄素作为干预药物,通过体外内实验,分别检测结肠癌SW620 细胞及肿瘤组织内NKD2 和CXCR4 的表达水平情况,来探讨姜黄素的抑瘤作用及其机制。
  1 材料与方法
  1.1 材料
  抗体NKD2(购自NOVUS 公司),CXCR4(购自Thermo 公司),β-actin(购自BD 公司),姜黄素(购自Sigma 公司)。NKD2 siRNA 由上海吉玛制药技术有限公司合成(NKD2-homo-962 序列,正义链:5′-CAGAUACACAUGCCGUACATT-3′ , 反义链:5′-UGUACGGCAUGUGUAUCUGTT-3′;NKD2-homo-480 序列,正义链:5′-CACGCUCUAUGACUUUGACTT-3′,反义链:5′-GUCAAAGUCAUAGAGCGUGTT-3′)。NKD2引物和CXCR4 引物由上海铂尚生物合成(NKD2 引物, 上游引物:5′-ATGCCTCGGTCAACCACTCC-3′,下游引物:5′-TCTGCCAGTTCACCCTCCATC-3 ′,其产物长度为151bp;CXCR4 引物, 上游引物:5′ -CCGTGGCAAACTGGTACTTT-3′,下游引物:5′-GACGCCAACATAGACCACCT-3′,其产物长度为188bp)。人类结肠癌细胞株SW620 来自浙江省重点实验室,所需的相关仪器和设备由浙江大学邵逸夫实验室提供。
  1.2 动物
  实验动物为BALB/c 裸鼠8 只,3~4 周龄, 体重15~18g,由浙江中医药大学实验动物中心提供,SPF实验室饲养, 实验动物使用许可证号SCXK (沪)2008-0016。由浙江中医药大学实验动物中心饲养,饲养温度20±2℃,适应环境5d,适应期间所有动物均自由摄食和饮水。
  1.3 药物
  姜黄素用DMA∶EL∶NS 以1∶4∶15 的比例配置成浓度为100mg/kg 的悬液; 对照组为DMA∶EL∶NS 以1∶4∶15 的比例配置液体;4℃冰箱保存, 临用前室温放置40min,防止颗粒析出。
  1.4 方法
  1.4.1 细胞培养和转染
  人类SW620 结肠癌细胞在37℃和5%CO2条件下, 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基培养。细胞存活率大于80%, 使用0.025%胰蛋白酶(EDTA)消化3~5min,以1∶3~1∶4 的比例传代。实验所用细胞均处于对数生长期。当细胞密度达到30%~50%左右时, 按照Lipo 2000 转染试剂盒说明书使siRNA 转入到细胞内,培养细胞48h,丢弃原先的培养液,再进行其他实验,最后提取细胞蛋白或RNA。
  1.4.2 Western blot 检测蛋白变化
  通过Western blot 检测各组细胞内β-actin、NKD2 和CXCR4 蛋白的表达量。用不同浓度姜黄素(0、10、20、40μmol/L)处理细胞24h,提取各组细胞总蛋白。姜黄素处理NKD2 siRNA 转染后72h 的SW620 细胞24h,提取各组细胞总蛋白。BCA 检测试剂盒测定各组细胞的蛋白浓度。分别取总蛋白20μg 上样,经12% 分离胶及5% 浓缩胶SDSPAGE 凝胶电泳后湿转法转PVDF 膜。加入特异性一抗(兔抗人NKD2 多克隆抗体,稀释度为1∶1000;兔抗人CXCR4多克隆抗体,稀释度为1∶1500;内参β-actin 抗体,稀释度1∶2000)4℃ 过夜。与二抗( 羊抗兔单克隆抗体,稀释度1∶1000) 室温孵育2h 后,ECL 化学发光剂于暗室中曝光和显影。实验重复3 次。
  1.4.3 Real-time qPCR 检测mRNA 变化
  通过Real-time qPCR 检测各组细胞NKD2、CXCR4 mRNA 的表达水平。不同浓度姜黄素(0、5、10、20μmol/l)处理细胞24h,提取各组细胞总RNA,电泳鉴定其完整性。用姜黄素处理NKD2 siRNA 转染后72h 的SW620 细胞24h, 提取各组细胞总RNA,电泳鉴定其完整性。cDNA Archieve 试剂盒逆转录总RNA, 得到cDNA, 用ddH2O 稀释。再以cDNA 以模板, 与基因特异性引物, 通过PCR 扩增CXCR4 和NKD2。对解离曲线进行分析,确保只有单一产物被扩增。最终进行测定分析。实验重复3 次。
  1.4.4 体内实验
  动物造模:培养SW620 结肠癌细胞,当细胞融合度达到95%时弃掉培养液, 采用胰酶消化细胞,将细胞吹打脱壁后吸入离心管离心, 用无血清培养液稀释, 确保每只裸鼠右腋皮下接种细胞数量6×106,每只0.2ml,观察其皮肤表面移植瘤成功率。分组及给药:8 只裸鼠随机分成姜黄素组和对照组,每组4 只(编号1~4 是对照组,编号5~8 是姜黄素组)。于接种后第4d 后开始成瘤,第7d 开始给药。姜黄素组给予姜黄素悬液按100mg/kg·d 的比例给药, 约0.2ml/只腹腔注射,1 天1 次, 连续用药14d,常规饲养;对照组给予用DMA∶EL∶NS 以1∶4∶15的比例配置的溶液给药,0.2ml/只腹腔注射,1 天1次,连续14d,常规饲养。标本采集:给药后,用游标卡尺测量荷瘤裸鼠肿瘤的最长径(a)和最小径(b),按V=0.5a(b2)计算肿瘤体积,隔天测量1 次,同时测量裸鼠重量。停药后脱颈处死,剥取移植瘤,再次测量肿瘤体积,计算抑瘤率。抑瘤率=(对照组瘤体积-实验组瘤体积)/对照组瘤体积×100%。取得的肿瘤组织一部分保存在-80℃冰箱,以待提取组织RNA。
  Western blot 方法检测组织蛋白表达:每例标本取肿瘤组织约50mg,加入细胞裂解液、研磨、离心,BCA 法测定总蛋白浓度。取总蛋白20μl, 电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭,加入一抗、二抗孵育,,ECL 化学发光剂于暗室中曝光和显影。分别检测组织中的NKD2 及CXCR4 蛋白表达水平。实验重复3 次。Real-time qPCR 方法检测组织mRNA 表达:每例标本取肿瘤组织约50mg,通过研磨、加入TRIZOL试剂等对其进行RNA 提取,测定总RNA 浓度。再通过cDNA Archieve 试剂盒逆转录总RNA, 得到cDNA,用ddH2O 稀释。再以cDNA 以模板,与基因特异性引物,通过PCR 扩增CXCR4 和NKD2。对解离曲线进行分析,确保只有单一产物被扩增。最终进行测定分析。实验重复3 次。
  1.5 统计学处理
  计量资料以均数±标准差(x±s)表示,用t 检验、单因素方差分析,所有数据均以SPSS19.0 统计软件分析数据。
  2 结果
  2.1 体外实验结果
  2.1.1 姜黄素对结肠癌细胞SW620 增殖活性的影响不同浓度(0~ 40μmol/l)的姜黄素作用细胞24h后,结肠癌细胞的生长受到不同程度的抑制,且呈浓度依懒性(Figure 1)。
  2.1.2 不同浓度姜黄素处理后对细胞内NKD2 和CXCR4 蛋白和mRNA 表达的影响不同的姜黄素浓度(0、10、20、40μmol/L ) 对SW620 细胞作用24h,观察NKD2 和CXCR4 蛋白及mRNA 表达水平。Western 印迹(Figure 2A)显示,姜黄素组与阴性对照组相比,NKD2 蛋白的表达水平显著性增加,CXCR4 蛋白表达水平显著性下降(P<0.05)。值得注意的是,随着姜黄素浓度的增加,其蛋白表达水平改变越明显。Real-time qPCR(Figure 2B、C)显示,姜黄素组与阴性对照组相比,NKD2 mRNA表达水平显著性增加,CXCR4 mRNA 表达水平显著性下降(P<0.01)。随着姜黄素浓度的增加,其CXCR4mRNA表达水平改变也越明显。
  2.1.3 转染NKD2 siRNA 处理肿瘤细胞SW620 后,姜黄素对CXCR4 蛋白和mRNA 表达的影响Western 印迹(Figure 3A)显示,CXCR4 蛋白的表达水平在NKD2 siRNA 转染组与阴性对照组相比显著性增加(P<0.05)。Real-time qPCR(Figure3 B)显示,CXCR4 mRNA 的表达水平在NKD2 siRNA 组与阴性对照组相比增加,差异有统计学意义(P<0.01)。
  2.2 体内实验结果
  2.2.1 一般情况及抑瘤情况
  皮下接种后第4d 各组裸鼠腋下皮肤表面开始出现高粱米粒大小的移植瘤,成瘤率为100%。4d 后瘤体生长加快,7d 各组裸鼠瘤体的a 和b 平均达4mm 和4mm 左右。第7d 开始给药,两组肿瘤体积均不断增加。连续用药14d 后,姜黄素组肿瘤体积达1406.346 ±382.320mm3, 对照组肿瘤体积达2029.196±540.503mm3(P<0.05)。姜黄素组瘤质比(肿瘤体积/裸鼠质量)为67.58±22.87,对照组瘤质比为104.02±24.17(P<0.05) 。
  2.2.2 肿瘤组织内NKD2 及CXCR4 的mRNA 表达水平Real-time qPCR(Figure 4A)显示,姜黄素组与对照组相比,NKD2 mRNA 的表达水平明显增加,而CXCR4 mRNA 的表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。
  3 讨论
  转移作为结肠癌恶化的特征, 也是晚期结肠癌患者死亡的主要因素,多见于肝、肺、腹膜转移。目前,研究表明上皮间质转化(EMT)在肿瘤转移中发挥关键的作用。上皮间质转化(EMT)具有降低细胞与细胞之间的粘附力,使细胞极性消失,从而增加细胞的迁移和侵袭能力。因此,结肠癌转移的发生与EMT 密切相关。Wnt 信号通路作为EMT 的重要途径, 在人类疾病包括癌症和胚胎发育中发挥重要的作用。目前Deng 等报道,在结肠癌患者中塞来考昔能抑制Wnt 信号通路, 起到抑制肿瘤生长的作用。此外,在肿瘤的发生发展过程中,趋化因子起着非常重要的作用。Hu 等研究发现,在结直肠癌患者中CXCR4 能促进CRC 的进展和EMT。Wang 等观察到CXCR4 在人类卵巢癌细胞的转移中通过调控Wnt /β-catenin 的信号途径发挥关键的作用。姜黄素是从姜科植物根茎中提取的一种抗氧化剂多酚,其药理作用广泛且毒副作用小。近年来大量研究表明姜黄素能够抑制致癌物质的活化和血管生成,具有调节细胞存活和凋亡的作用,对肺癌、乳腺癌和前列腺癌等均有抗侵袭和抗转移的功效,其抗肿瘤的分子机制成为研究热点。但其抗肿瘤机制较为复杂,抑瘤的分子机制尚未完全阐明。
    本研究结果显示, 姜黄素在体外能明显抑制结肠癌细胞的增殖活性,具有抑制肿瘤细胞生长的作用。同时,实验结果表明姜黄素在体外内对Wnt 信号通路中的抑制基因NKD2 具有明显上调作用, 对趋化因子CXCR4 具有明显的抑制作用。此外,NKD2 作为Wnt信号通路的上游基因,同时也是该通路的抑制基因,很可能姜黄素通过上调抑制因子NKD2 的表达从而抑制Wnt 信号通路, 进而抑制结肠癌细胞侵袭转移。因此,本实验再通过转染NKD2 siRNA 后,发现能显著性上调姜黄素处理后细胞内CXCR4 的表达水平, 该结果说明姜黄素对CXCR4 的调控作用受到NKD2 表达水平的影响, 从而起到抑制肿瘤侵袭转移的能力。
  综上所述, 姜黄素在体内外均能显著性上调NKD2 的表达及下调CXCR4 的表达水平。同时姜黄素抗肿瘤生长及转移的作用机制可能通过上调NKD2 的表达,抑制Wnt 信号通路,进而抑制肿瘤细胞CXCR4 的表达。但其姜黄素抑制肿瘤的作用机制是否与其影响的Wnt 信号通路和EMT 密切相关尚待进一步研究。
 

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